RJ11723人γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒

干擾素（ IFN-γ ,  又稱  II  型干擾素或免疫干擾素）是一種主要由T淋巴細胞 和自然殺傷細胞產(chǎn)生的細胞因子。該蛋白與IFN-β或各種IFN-α家族蛋白沒 有明顯的同源性。成熟的  IFN-γ以非共價連接的同質(zhì)體存在。人類IFN-γ具 有高度的物種特異性 ，只在人類和靈長類細胞中具有生物活性。IFN-γ最初 是基于其抗病毒活性而被定性的。該蛋白還發(fā)揮抗增殖、免疫調(diào)節(jié)和促進炎 癥的活性 ， 因此在宿主防御機制中很重要。IFN-γ誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生 ，上 調(diào) I  類和 II  類  MHC  抗原、Fc  受體和白細胞粘附分子的表達。它調(diào)節(jié)巨 噬細胞的效應(yīng)功能 ，影響異型轉(zhuǎn)換并增強 B  細胞分泌免疫球蛋白的能力。

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA） 。往預(yù)先包被有人 γ干擾素(IFN-γ)捕獲抗體的微孔中 ，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢 測抗體 ，HRP酶結(jié)合物 ， 中間經(jīng)過溫育和洗滌 ，用底物TMB顯色 ，TMB在過 氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色 ，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色 的深淺和樣本中的人γ干擾素(IFN-γ)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm  波長下測 定吸光度（ OD值） ，計算樣本濃度。

靈敏度：0.54pg/mL

特異性：可檢測樣本中人的IFN-γ ,  且與其類似物無明顯交叉反應(yīng)

1.    試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍 ，建議實驗前通過相 關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度。如 果樣本中待測物濃度過高或過低 ，請對樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。

2.    若所檢樣本不在說明書所列樣本類型之中 ，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有 效性。

3.    血清 ：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時或2-8℃過夜 ，    然后1000×g離心20分鐘 ，取上清即可 ，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存， 但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4.    血漿 ：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本 ，并將樣本在采集后的30分  鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘 ，取上清即可檢測 ，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃ 或-80℃保存 ，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5.    組織勻漿 ：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織 ，去除殘留血液（勻  漿中裂解的紅細胞會影響檢測結(jié)果） ，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組 織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比 ，比如1g的組織樣本對應(yīng) 9mL的PBS ，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整 ，并做好記錄。推薦在  PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中 ，于冰上充分研磨或勻漿  機研磨。為了進一步裂解組織細胞 ，可以對勻漿液進行超聲破碎 ，或反 復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~ 10分鐘 ，取上清檢測。

6.    細胞培養(yǎng)物上清 ：請1000×g離心20分鐘 ，取上清即可檢測 ，或?qū)⑸锨?/span>

置于-20℃或-80℃保存 ，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

7.    細胞裂解液 ：貼壁細胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗 ，然后用胰蛋白酶消化，

1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞   用預(yù)冷PBS清洗3次 ，每1×10^6個細胞中加入150-200μL PBS重懸（推     薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通    過反復(fù)凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃ ,  1500×g離心10分鐘， 取上清檢測。

8.    其它生物樣本： 1000×g離心20分鐘 ，取上清即可檢測。

9.    樣本外觀 ：樣本應(yīng)清澈透明 ，懸浮物應(yīng)離心去除。

10.  樣本保存 ：樣本收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃ ,  若不能及時 檢測 ，請按一次使用量分裝 ，凍存于-20℃（ 1個月內(nèi)檢測） ，或-80℃    （ 6個月內(nèi)檢測） ，避免反復(fù)凍融 ，樣本溶血會影響最后檢測結(jié)果 ， 因   此溶血樣本不宜進行此項檢測。

 請?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 100 倍稀釋；

稀釋 1000 倍 ：兩步稀釋。取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 20 倍稀釋 ， 再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ， 做 50 倍稀釋 ， 總共稀釋 1000 倍；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 40 倍稀 釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，最后取 5 μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 100000 倍；

每步稀釋時取液量不少于 3μL ，稀釋倍數(shù)不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均 勻 ，避免起泡。

1.    請?zhí)崆?/span>從冰箱中取出試劑盒 ，平衡至室溫。

2.    標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入 1mL  通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中 ，靜置15 分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為100pg/mL)，然后按照以下濃度：

100pg/mL、 50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、6.25pg/mL、3. 12pg/mL、

1.56pg/mL、0pg/mL進行稀釋。

倍比稀釋方法 ：取7支EP管 ，每管中加入500μL通用稀釋液, 100pg/mL  的    標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成50pg/mL  的標(biāo)準(zhǔn)品工 作液 ，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔 ，不需要再 從倒數(shù)第二管中吸取液體 ，具體如下圖。

3.    生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮生物素化檢抗于  1000×g離心1分鐘 ，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化檢抗稀釋成1×工 作濃度(例： 10μL濃縮液+990μL通用稀釋液) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.    酶結(jié)合物工作液配制 ：使用前15分鐘將100×濃縮酶結(jié)合物于1000×g離 心1分鐘 ，以通用稀釋液將100×濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作濃度(例： 10 μL濃縮液+990μL通用稀釋液) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.    1×洗滌液配制：取10mL 20×洗滌液到190mL蒸餾水中（從冰箱中取出的 濃縮洗滌液可能有結(jié)晶 ，屬于正常現(xiàn)象 ，可放置室溫 ，待結(jié)晶溶解 后再配制)。

操作步驟：

1.    從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條 ，剩余板條用自封袋密封 放回4℃。

2.    加樣 ：分別將樣本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μL每孔加入相應(yīng)孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：

將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試。從而減   少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的影響 ，最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋 倍數(shù)。所有的待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3.    加生物素化檢抗 ：取出酶標(biāo)板 ，棄去液體 ，不用洗滌。每孔直接加入

100μL生物素化檢抗工作液 ，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。

4.    洗板 ：棄去液體 ，每孔加入300μL 1x洗滌液 ，靜置1分鐘 ，甩去洗滌液， 吸水紙上拍干 ，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機洗板）。

5.    加酶結(jié)合物工作液 ：每孔加入100μL酶結(jié)合物工作液 ，蓋上封板膜后 37℃溫育30分鐘。

6.    洗板 ：棄去液體按步驟4洗滌方法 ，洗板5次。

7.    加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，蓋上封板膜 ，37℃避光溫育15分鐘。

8.    加終止液 ：取出酶標(biāo)板 ，每孔直接加入50μL終止液 ，立即在450nm波長 處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1.    計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均  OD  值并減去空白孔的  OD  值作為校 正值。 以濃度為橫坐標(biāo) ，OD  值為縱坐標(biāo) ，在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參 數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.    若樣本 OD  值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限 ，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度 時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考 ，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意 ：本圖僅供參考 ，應(yīng)以每次實驗數(shù)據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本含量。

1.    重復(fù)性 ：板內(nèi)變異系數(shù)小于  10% ，板間變異系數(shù)小于  10%。

2.    回收率 ：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入  3  個不同 濃度水平的人IFN-γ ,  計算回收率。

3.    線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入

高濃度人IFN-γ ,  在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋 ，評估線性。