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      小鼠雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(ELISA)

      發(fā)布時間:2025-02-07   點(diǎn)擊次數(shù):389次

      小鼠雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(ELISA)

      本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。在預(yù)包被抗小鼠雌二醇(E2)抗體(固相抗體)的微孔酶標(biāo)板中,加入小鼠雌二醇(E2)校準(zhǔn)品和待測樣本,再加入HRP標(biāo)記的小鼠雌二醇(E2)抗原(酶標(biāo)抗原),經(jīng)過溫育與充分洗滌,去除未結(jié)合的組分,在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物。加底物A和B,底物在HRP催化下,產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物,在終止液(2M 硫酸)作用下,最終轉(zhuǎn)化為黃色,在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度(OD值),吸光度(OD值)與待測樣品中小鼠雌二醇(E2)的濃度負(fù)相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線,可以計算出樣本中小鼠雌二醇(E2)的濃度。

      小鼠雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(ELISA) 

      試劑盒限制性

      1、 僅供科研使用,不得用于臨床診斷。

      2、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用,過期產(chǎn)品不得使用。

      3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

      4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋

      5、 如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值請將樣本適當(dāng)稀釋后,再重新測定

      6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果,檢測前,請排出該因素。

      7、 通過其他方法得到的檢測結(jié)果,與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

      技術(shù)提示

      1、 混合蛋白溶液,避免泡。

      2、 加校準(zhǔn)品與樣本時,每個校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,公共組分應(yīng)該懸臂加樣,避免交叉污染。

      3、 合適的溫育時間,和充分的洗滌步驟,是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

      4、 使用自動洗板機(jī)時,加入一個30秒浸泡的步驟,可提高檢測精度。

      5、 底物溶液為無色液體,保存過程中變?yōu)樗{(lán)色,代表底物溶液已經(jīng)失效,不得使用。

      6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,加入終止液后,藍(lán)色底物產(chǎn)物,會瞬間變?yōu)辄S色。

      7、 實(shí)驗(yàn)中,用剩的板條,應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

      8、 所有液體組分,使用前充分搖勻,嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

      小鼠雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(ELISA) 

      試劑盒組分與保存

      未開封的試劑盒保存在2-8度,不得使用過期試劑盒。

      組分

      數(shù)量

      主要成分

      開封后儲存

      校準(zhǔn)品

      0.3ml/管

      --

      2-814天

      包被微孔板

      96T/48T

      預(yù)包被固相抗體

      2-814天

      HRP標(biāo)記抗原

      10mL

      HRP標(biāo)記的檢測抗原

      2-8180天

      底物液A

      6mL

      0.01%過氧化氫

      2-8180天

      底物液B

      6mL

      0.1%TMB

      2-8180天

      終止液

      6mL

      2mol/L稀硫酸

      2-8180天

      樣本稀釋液

      6mL

      PBS

      2-8180天

      20×濃縮洗滌液

      25mL

      0.05%Tween20

      2-8180天

      說明書

      1份

      --

      --

      自封袋

      1個

      --

      --

      不干膠

      2片

      --

      --

      標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:6432、16、8、4、0 pmol/L.

      其他用品

      1、 酶標(biāo)儀(450nm)

      2、 精密移液器及一次性吸頭

      3、 蒸餾水

      4、 洗瓶或者自動洗板機(jī)

      5、 37水浴鍋或恒溫箱

      6、 500ml量筒

       

      生物安全

      1、 檢測必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定,嚴(yán)格防止交叉污染,所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

      2、 試劑盒的液體組分中,含有proclin-300防腐劑,可能引起皮膚過敏反應(yīng)避免吸入煙霧與皮膚接觸

      3、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用,避免吸入煙霧。

      4、 戴上防護(hù)手套,實(shí)驗(yàn)完成后洗手。

       

      樣品的采集和儲存

      以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中,不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

      1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清:4000rpm條件下離心20min,去除細(xì)胞顆粒和聚合物,上清液保存- 20以下避免反復(fù)凍融。

      2、 血清使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,4000rpm條件下離心20min,小心地分離出血清,保存-20以下避免反復(fù)凍融。

      3、 血漿肝素,EDTA,或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下,離心20分鐘取上清,血漿保存-20以下,避免反復(fù)凍融。

      樣本收集后,無法一次檢測完畢,請按一次用量分裝凍存,避免反復(fù)凍融,使用時在室溫下解凍,確保樣品均勻充分解凍。

      4、 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液,稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘,取上清檢測。

      5、 細(xì)胞提取液:貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞;懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸并通過復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘,取上清檢測。  

      6、 其他生物體液:1000×g 離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。

       

      試劑準(zhǔn)備

      1、 使用前,所有的組分都要至少復(fù)溫60min,確保充分復(fù)溫到室溫。

      2、 濃縮洗滌液:從冰箱取出的濃縮洗滌液,會有結(jié)晶產(chǎn)生,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水,按1:20稀釋,即1份的濃縮洗滌液,添加19份的蒸餾水

      3、 底物:底物液A和B,在使用前,按1:1體積充分混合,混合后15分鐘內(nèi)使用。

       

       

      操作程序

      所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品,建議做復(fù)孔。

      1、 按前面說明書描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。

      2、 從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

      設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,空白孔不加,樣本孔加待測樣本50μL。

      3、除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗原100μL。

      4、 用封板膜蓋住反應(yīng)板,37水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

      5、 揭開封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置20S,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機(jī),請按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,添加浸泡30s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應(yīng)板。

      6、 將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL用封板膜蓋住反應(yīng)板,37水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

      7、 所有孔加入終止液50μL,在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度(OD值)。

      結(jié)果計算

      1、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo),對應(yīng)的吸光度(OD值)作為縱坐標(biāo),利用計算機(jī)軟件,采用四參數(shù)Logistic曲線擬合(4-pl),創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,通過樣本的吸光度(OD值),利用方程計算樣品的濃度值。

      2、 如果樣品被稀釋,通過上述方法測的濃度值,要乘以稀釋倍數(shù),才是樣品的最終濃度。

       

       

      試劑盒性能指標(biāo)

      1、物理性能

      試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,無破損漏氣。

      2、劑量反應(yīng)曲線線性

      校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,大于等于0.9900。

      3、精密度

      批內(nèi)精密度:已知的高、中、低濃度樣品進(jìn)行二十次在一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

      批間精密度:已知的高、中、低濃度樣品進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

      4、靈敏度

      小于0.1 pmol/L。

      5、回收率

      已知的高、中、低濃度樣品進(jìn)行次在一個板塊內(nèi)回收率評估,回收率在85%-115%之間。

      6、特異性

      本試劑盒識別天然和重組小鼠雌二醇(E2),與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。

      7、穩(wěn)定性

      2-8保存,有效期6個月。

      8、 檢測范圍

      2 pmol/L - 64 pmol/L


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